摘    要：　目的 探索一种较佳的病理快速冷冻切片染色质控片的制备方法。方法 随机抽取60例快速冷冻组织, 每例取2块组织, 随机分为A、B二组, 在-25℃速冻后, A组 (标准组) 切片放入AAF液 (由95%乙醇A、乙酸A、甲醛F按85:5:10的比例配制而成) 固定30s后立即进行HE染色, B组切片放入AAF液固定30s后取出室温晾干后放进冷冻切片机内过夜。余下的A组及B组组织进行后续2种不同的操作。C组:得到A组切片后的组织不做任何处理, 直接放冷冻切片机机箱内, 并将冷冻切片机箱体温度调高至-10℃, 第二天上午再次调至-25℃;D组:得到B组切片后的组织于组织上加包埋剂覆盖后放冷冻切片机机箱内, 余操作同C组。C、D两组于第二天上午8点再次进行冷冻切片后同B组一同进行HE染色, 以十分制评定切片有无裂隙、皱褶或冰晶, 染色后组织结构、细胞核着色和核质对比清晰度等6项指标的得分, 分别与A组的染色片进行比较。结果 A、B两组切片质量评价指标得分无明显差别, C组切片无裂隙指标得分低于A组, D组无冰晶指标得分低于A组;B、C两组的组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰指标得分与A组比较无显着差异;D组组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰指标得分均低于A组。结论 新鲜的组织冷冻切片后, 切片立即放入AAF液固定30s, 随后取出, 常温晾干后再次放进冷冻切片机机箱内过夜直至第二天上午放入全自动染色机内进行HE染色, 观察染液的染色力, 适用于每天快速冷冻切片工作开展前的全自动染色机的染色质控。

　　关键词：　快速冷冻切片; 染色质控片;
 

　　Abstract：　Objective To explore a better preparation method of quality control slides for pathological rapid frozen section staining. Methods 60 cases of rapid frozen tissues, including thyroid tissue, breast tissue and lung tissue (20 cases each tissue) , were randomly selected. Two tissue samples taken from each case were divided randomly into group A and group B (that is, 60 tissue samples each group) . After rapidly frozen in the freezing microtome with a setting temperature-25℃, the tissue blocks were cut to obtain one section from each sample. The sections from group A (Control A) were put into AAF solution (prepared in a ratio of 85:5:10 with 95% ethanol, acetic acid and formaldehyde) and fixed for 30 s and stained with HE immediately, while the sections from group B (Control B) were put into the freezing microtome overnight after 30 s' fixation and then dried at room temperature. The remaining tissues from group A and B were carried out the following operations. The tissues for Control C were obtained from group A and placed directly in the freezing microtome without any other treatment, in which the temperature was raised to-10℃ and adjusted from-10℃ to-25℃ at 8:00 a.m. the next day (after 15 hours) . The tissues for Control D were obtained from group B and covered with embedding reagent, then placed in the freezing microtome, and the rest operations were the same as Control C. After frozen sectioning again, the sections of Control C and D were stained together with the sections of Control B with HE at 8:00 a.m. the next day. The scores of the six indexes, including no crack, no wrinkles, no ice crystal, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm were evaluated by a 10-point scale, each of which was respectively compared with that of Control A. Results There was no significant difference in the scores of no crack, no wrinkle or no ice crystal indexes between Control A and B; while the scores of no crack index in Control C and the scores of no ice crystal index in Control D were lower than those in Control A. Compared with Control A, there was no statistically significant difference in the scores of clear tissue structure, bright nucleus or clear contrast between nucleus and cytoplasm index in Control B and C, while the scores of clear tissue structure, bright nucleus or clear contrast between nucleus and cytoplasm in Control D were all lower than those in Control A. Conclusion The procedure that, making frozen slices with fresh tissue, putting the frozen sections into the AAF solution immediately for 30 s, and taking them out to dry at room temperature, then placing the sections in the freezing microtome overnight until the next morning at 8 a.m. followed by HE staining in a fully automatic staining machine to observe the dyeing effect of the staining solution, is suitable for the quality control of automatic staining machine before the daily pathological rapid frozen section staining.

　　Keyword：　Rapid frozen section; quality control slides for staining;

　　冷冻切片是快速将组织冷冻成一定的硬度、切出薄片的过程[1]。随着对术中冷冻切片的深入研究, 目前术中冷冻切片已经广泛应用于病理诊断中[2,3]。病理冷冻切片制作质量的好坏, 会影响病理医生的诊断准确性。在有限的时间内又快又好地完成冷冻切片的制片, 不仅是病理诊断的需要, 更是术中外科医师的迫切要求[4]。近年来, 随着各种检测技术不断实现现代化, 全自动染色机已逐渐应用于快速冷冻切片HE染色中, 而病理技术工作者面临着如何对冷冻切片染色机内的染液进行质控的难题。以往全自动染色机应用于组织脱水处理后的常规HE切片的染色时, 只需将常规HE切片放进染色机内, 依照染色结果对机内的染色液进行调整。冷冻切片的染色液种类及其流程与常规HE切片染色无异, 但两者的染色时间显着不同, 常规HE切片不能用于冷冻切片染色程序染液的质控。冷冻切片制片过程中, 如果染液未做好质控, 冷冻切片染色效果不佳时, 再来调整染色机内染液, 重新进行冷冻切片与染色就将显着延长冷冻切片出片时间, 严重影响病理诊断及时率并拖延手术的等待时间。故笔者通过实验, 旨在探索一种较佳的冷冻切片HE染色染液质控方法。

　　一、材料与方法

　　1、 材料

　　随机抽取2017年9月至2017年12月厦门大学附属第一医院病理科的快速冷冻切片标本60例, 其中甲状腺组织20例, 乳腺组织20例及肺组织20例。患者性别及年龄无限制。

　　2、 主要设备

　　LEICA CM1950冷冻切片机 (德国莱卡) ;DAKEWE (达科为) 全自动染色机。

　　3、 主要试剂

　　包埋剂, AAF液 (由95%乙醇A:乙酸A:甲醛F=85:5:10组成) , 新鲜配制的Harri苏木素染液, 1%盐酸乙醇液, 饱和碳酸锂溶液, 0.5%酸化伊红, 75%乙醇, 85%乙醇, 95%乙醇, 无水乙醇。

　　4、 取材

　　新鲜送检组织取材大小约为1.5cm×1.5cm×0.3cm, 每一个病例取2块组织, 随机分为A、B两组 (每组60块) , 所有组织块切取后均立即放置于冷冻切片机托头上, 加适量的包埋剂, 将托头连同组织放置于已预先设置至-25℃的冻台上速冻。

　　5、 冷冻切片的制作

　　为保证实验更加准确, 实验切片的制作都采用新刀片。

　　5.1、 A组切片制备

　　A组组织用冷冻切片机各切取一张厚度为5~6μm的冷冻切片, 立即放入AAF液固定30s, 然后置于染液已经质控的DAKEWE全自动染色机内进行HE染色:水洗5s→新鲜配制的Harri苏木素染液90s→自来水冲洗15s→1%盐酸乙醇液1s→自来水冲洗1s→饱和碳酸锂溶液4s→自来水冲洗15s→0.5%酸化伊红2s→自来水冲洗15s→75%乙醇2s→85%乙醇2s→95%乙醇1s→无水乙醇1s, 染色结束后吹干, 中性树胶封片。

　　5.2、 B组切片制备

　　B组组织用冷冻切片机各切取一张厚度为5~6μm的冷冻切片, 立即放入AAF液固定30s, 随后取出, 室温晾干后再次放进冷冻切片机机箱内, 第二天上午8点取出, 然后置于DAKEWE全自动染色机内进行染色, 染色方法同A组。

　　5.3、 C组切片制备

　　得到A组切片后的组织, 不做任何处理, 直接放置于冷冻切片机机箱内, 调节冷冻切片机箱温至-10℃直至第二天上午8点, 再将冷冻切片机冻台设置至-25℃、夹头温度设置至-17℃后, 用冷冻切片机再各切取一张厚度为5~6μm的冷冻切片, 立即放入AAF液固定30s, 然后置于染液已经质控的DAKEWE全自动染色机内进行染色, 染色方法同A组。

　　5.4、 D组切片制备

　　得到B组切片后的组织, 于组织上加适量包埋剂覆盖后, 放冷冻切片机机箱内, 其余操作同C组。

　　6、 冷冻切片质量观察指标

　　切片质量评价:观察切片的组织裂隙、皱褶和冰晶, 以10分制评分。评分标准:若切片的组织无裂隙、无皱褶、无冰晶, 则每项指标得分均为10分;若切片上X%面积的组织出现相应的指标, 则该指标得分为10-X/10。例如, 某切片上25%面积的组织有裂隙, 则该切片裂隙指标得分为10-25/10=7.5分。以此类推。

　　染色效果评价:观察各组切片染色后组织结构、细胞核着色和核质对比清晰度, 以10分制评分。评分标准:若切片组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰, 则每项指标得分均为10分;若切片组织结构轻度模糊, 尚不影响观察, 减1~2分;组织结构模糊, 一定程度的影响观察, 减3~6分;组织结构模糊不清, 严重影响观察, 减7~10分。2名高级质控师进行双盲评片, 每项指标的数据为评分的均值。结果采用?±s表示。

　　7、 全自动染色机染液质控方法

　　选取待染冷冻切片放入全自动染色机内进行HE染色, 染色完成后, 镜下观察切片染色质量, 染色效果好 (组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰) 则无需对染液进行更换或调整染色时间, 可直接进行后续的快速冷冻切片染色;若镜下观察切片染色质量差, 则需针对染色结果, 进行相应的染液更换或调整染液染色时间, 再进行一次质控测试, 直至测试结果显示染色效果好为止。

　　8、 统计学分析

　　采用SPSS 17.0软件进行统计分析, 数据以±s表示。将B、C、D 3组冷冻切片的切片质量与染色效果各项指标分别与A组进行比较, 2组间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

　　二、结果

　　1、冷冻切片切片质量的比较

　　不同制备方法所制冷冻切片无裂隙、无皱褶、无冰晶指标得分情况见表1。A、B两组切片的裂隙、皱褶、冰晶指标得分比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) ;C组切片裂隙指标得分低于A组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;D组切片后组织冰晶指标得分低于A组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。A组染色片 (图1A) 无裂隙、无皱褶、无冰晶;B组染色片 (图1B) 无裂隙、无皱褶、无冰晶;C组染色片 (图1C) 有裂隙、无皱褶、无冰晶;D组染色片 (图1D) 无裂隙、无皱褶、有冰晶。

　　表1 4组冷冻切片质量评价得分Tab.1 4 groups of frozen sections quality evaluation scores

　　与A组比较:a P<0.01Compared with group A:a P<0.01

　　2、冷冻切片染色效果的比较

　　4组冷冻切片染色效果评分结果显示, B、C 2组组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰指标得分分别与A组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) ;D组组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰指标得分均分别低于A组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。A组染色片 (图1A) 组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰;B组染色片 (图1B) 组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰;C组染色片 (图1C) 组织结构清晰、细胞核鲜艳、核质对比清晰;D组染色片 (图1D) 组织结构欠清晰、细胞核不鲜艳、核质对比不清晰。

　　表2 4组冷冻切片染色效果评分结果Tab.2 4 groups of frozen sections staining effect score

　　与A组比较:b 0.01<P<0.05Compared with group A:b 0.01<P<0.05

　　三、讨论

　　快速冷冻切片主要用于病理医师对临床手术病人在术中的快速病理诊断, 是确定某些“低风险”病理参数的一般可靠工具[5], 方便外科手术医师在此基础上决定手术方案、范围及治疗方法, 故为了能更好、更快地将病理快速冷冻报告发给临床手术医师, 快速制作一张质量好的冷冻切片至关重要。

　　作者实践发现, 与传统手工染色方法比较, 全自动染色机应用于病理科的快速冷冻切片HE染色具有以下优势: (1) HE染色质量稳定。 (2) 省时省力。单片染色耗时上, 全自动染色机与传统手工染色相比无明显差异, 但前者能同时进行大批量染色, 而且节省人力[6], 技术人员可进行下一台快速冷冻的制片。 (3) 安全环保。全自动染色机在密闭的空间内完成染色操作, 大大减少了试剂的挥发性刺激, 同时也减轻对工作人员的化学危害及环境的污染[7]。

　　日常冷冻切片进行全自动HE染色过程中, 我们常遇到如下问题: (1) 未进行冷冻切片染色前, 染色机内染液的染色能力不能预知。 (2) 更换冷冻切片染色机内的苏木素、分化液、返蓝液或伊红等染液后, 如果没有进行试染, 其染色效果未知。 (3) 调整冷冻切片染色机内染液的染色时间后, 如果没有进行试染, 其染色效果未知。以上三个问题任何一个未处理好, 将有可能使得染出来的冷冻切片染色效果不佳, 而此时再来调整染色机内染液, 重新进行冷冻切片与染色就将大大延长冷冻切片出片时间。有了质量可靠的冷冻切片待染片, 在每天临床需进行快速冷冻切片的组织送至病理科前, 病理技术工作者有充裕的时间将冷冻切片待染片放入全自动染色机内进行HE染色, 通过镜下观察冷冻切片染色质量。当出现冷冻切片染色质量差的问题, 如组织结构不清晰、细胞核暗灰或核质对比不清晰, 则对苏木素、分化液, 反蓝液或伊红染液进行相应的更换, 或者对相应染液的染色时间进行调整。调整后再进行一次质控测试, 若测试结果满意, 则质控工作完成;若仍有染色质量问题, 则再进行下一次质控测试, 直至测试结果显示染色效果好为止。因此, 制作质量可靠的病理冷冻切片预染片至关重要。

　　为了探索一种较佳的病理冷冻切片染色质控片, 作者通过对比实验发现, B组实验得到的冷冻切片经过HE染色后, 切片质量及染色效果均与A组 (标准组) 相当, 且优于C、D组。B组实验方法具有以下优点: (1) 质量可靠; (2) 简便易行; (3) 通过保障病理冷冻切片质量, 避免患者在手术台上花过多时间等待病理冷冻切片报告, 减少并发症; (4) 通过质控, 进一步探索全自动染色机染多少片后需进行染液调换, 或几天后染液衰退需进行更换, 以逐渐达到标准化。实验过程中, 笔者发现本实验缺乏室间质控这一缺点, 我院病理科作为该市的病理质控中心, 还需不懈努力, 进一步推进这一工作。

　　图1 4组冷冻切片HE染色 (同一患者甲状腺和肺组织) 。A组切片无裂隙, 无皱褶, 无冰晶, 组织结构清晰, 细胞核鲜艳, 核质对比清晰;B组切片无裂隙, 无皱褶, 无冰晶, 组织结构清晰, 细胞核鲜艳, 核质对比清晰;C组切片有裂隙 (箭头所示) , 无皱褶, 无冰晶, 组织结构清晰, 细胞核鲜艳, 核质对比清晰;D组切片无裂隙, 无皱褶, 有冰晶 (箭头所示) , 组织结构欠清, 细胞核染色欠佳, 核质对比欠清;比例尺, 100μm Fig.1 HE staining of frozen sections in 4 groups (thyroid and lung tissues of the same patient) .Group A, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group B, it showed no crack, no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group C, it showed crack (indicated by the arrow) , no wrinkles, no ice crystals, clear tissue structure, bright nucleus and clear contrast between nucleus and cytoplasm;group D, it showed no crack, no wrinkles, ice crystals (indicated by the arrows) , unclear tissue structure, no bright nucleus, and unclear contrast between nucleus and cytoplasm;scale bar, 100μm

　　实验过程中发现, 冷冻后的组织块, 如果表面裸露, 经过冷冻过夜, 组织表面干燥, 组织容易出现裂隙, 尤其以甲状腺等细胞成分极为丰富的组织或肺等甚为疏松的组织更为显着, 但组织染色效果并不受影响。冷冻组织表面裸露后再加包埋剂后, 再置于冷冻切片机内冷冻, 其切片较平整, 裂隙及皱褶少, 但冰晶较明显, 组织染色质量下降, 尤其以疏松组织为甚, 笔者认为这可能是冷冻组织被包埋剂复温溶化, 再次被冷冻切片机的冻台冷冻, 当细胞外液开始结冰时, 细胞内还没结冰, 细胞外液电解质浓缩, 导致渗透压急剧升高, 细胞内水分子渗出细胞, 在细胞外形成冰晶, 有待更多的实验证明。

　　日常冷冻切片工作中, 染色的质控最主要通过细胞核及细胞质染色来了解染液的质量, 故笔者认为新鲜的组织冷冻切片后, 切片立即放入AAF液固定30s, 随后取出, 常温晾干后再次放进冷冻切片机机箱内过夜直至第二天上午8点放入全自动染色机内进行HE染色, 观察染液的染色力, 适用于每天快速冷冻切片工作开展前的全自动染色机的染色质控, 可供各病理科参考应用。

　　参考文献：

　　[1]丁伟, 王德田.简明病理学技术.杭州:浙江科学技术出版社, 2014:46.
　　[2]Sala P, Morotti M, Menada MV, et a1.Intraoperative frozen section risk assessment accurately tailors the surgical staging in patients affected by early-stage endometrial cancer:the application of 2 different risk algorithms.Int J Gynecol Cancer, 2014, 24 (6) :1021-1026.
　　[3]Wu C, Qu X, Mao Y, et a1.Utility of intraoperative frozen section in the diagnosis of periprosthetic joint infection.PLOS ONE, 2014, 19 (7) :e102346.
　　[4]薛晓伟, 孙保存, 王伟, 等.首届全国病理技术“华夏杯”冷冻切片总决赛结果分析.中华病理学杂志, 2016, 45 (6) :413-414.
　　[5]Desouki MM, Li Z, Hameed O, et al.Intraoperative pathologic consultation on hysterectomy specimens for endometrial cancer:an assessment of the accuracy of frozen sections, “Gross-Only”evaluations, and obtaining random sections of a grossly“Normal”endometrium.Am J Clin Pathol, 2017, 148 (4) :345-353.
　　[6]高鸽, 王连有, 张丽荣, 等.浸染式与滴染式HE染色工作站的应用对比.诊断病理学志, 2017, 24 (5) :392-393.
　　[7]张鹏, 包磊, 任丽芳, 等.全自动染色机与手工染色的比较及其染色程序的改进.临床和实验医学杂志, 2015, 31 (2) :224-225.

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